運輸方式

液氮運輸

1、吸附式液氮運輸，無游離液氮，冒白煙即說明正常。

2、溫度監測設備嚴密監控運輸過程中的罐內溫度，如發現異常可拷貝溫度記錄儀上的PDF和excel數據（溫度監測設備一頭可拔掉，顯示USB接頭，插入電腦即可拷貝數據，如遇到困難，可聯系銷售人員和技術支持解決）。

3、合金密碼鎖，保證從發出到收貨，沒有第三方可以打開液氮罐接觸細胞，保護細胞安全。

4、GPS定位器，細胞運輸軌跡全程掌握，防止丟件。

5、液氮罐、溫度監測設備、合金密碼鎖、GPS定位器為回收部件，請妥善保管，禁止破壞，否則會被拉入黑名單。

文章引用

1、CHEN Yi, TANG Dan, WU Hongping, et al. Assessment of long-term functional maintenance of primary human hepatocytes to predict drug-induced hepatoxicity in vitro[J]. Archives of Toxicology, 2021, 95(6): 1-26. DOI: 10.1007/s00204-021-03050-y.

2、Youquan Zhong # 1 2, Chuanjian Wu # 1, Zaichao Xu 1, Yan Teng 1, Li Zhao 1, Kaitao Zhao 1, Jingjing Wang 1, Wen Wang 3, Qiong Zhan 1, Chengliang Zhu 4, Xinwen Chen 5, Kaiwei Liang 3, Xiaoming Cheng 1 6 7, Yuchen Xia 1Hepatitis B Virus Core Protein Is Not Required for Covalently Closed Circular DNA Transcriptional Regulation. J Virol. 2022 Nov 9;96(21):e0136222. doi: 10.1128/jvi.01362-22. Epub 2022 Oct 13.

3、Lin Xu 1, Qianwen Zhao 1, Jiao Luo 1, Wanli Ma 1, Yuan Jin 1, Chuanhai Li 1, Yufei Hou 1, Meiyao Feng 1, Ying Wang 1, Jing Chen 1, Jinquan Zhao 1, Yuxin Zheng 2, Dianke Yu 3. Integration of proteomics, lipidomics, and metabolomics reveals novel metabolic mechanisms underlying N, N-dimethylformamide induced hepatotoxicity. Ecotoxicol Environ Saf. 2020 Dec 1:205:111166. doi: 10.1016/j.ecoenv.2020.111166. Epub 2020 Aug 19.

4、Zaichao Xu,Kaitao Zhao,Jingjing Wang,Lu Zhang,Jiatong Yin,Nijing Chen,Sijia Chen,Gaihong Zhao,Mengfei Wang,Tailai Xin,Chengliang Zhu,Xiaoming Cheng ,Yuchen Xia Screening of different species reveals cat hepatocytes support HBV infectionPublished: August 4, 2025 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1013390

5、Therapeutic inhibition of HBsAg and HBV cccDNA  through a novel phased combination treatment:  glycine and interferon-α

適用范圍

1、肝臟基礎研究，包括基礎肝臟疾病研究、病毒感染、基因表達調控。

2、藥物開發：藥物藥效、藥物毒性、藥物代謝、藥物相互作用。

基因操作方法

1、慢病毒，MOI=30-50可達到接近100%感染效率，需提前測試；

2、AAV，MOI=10^5可達到80%以上感染效率，需提前測試；

3、ASGPR-GalNac自由攝取，小核酸需提前修飾GalNac，可達到80%以上遞送效率；

4、不推薦Lipo2000/3000，原代肝細胞轉染毒性大、效率低，除非已經測試沒有問題。

由于我司產品說明書半年更新一次，以下步驟僅作參考，以公司隨貨說明書為準

II  試劑與材料

? 人原代肝細胞（Cat# LV-PHH001/2）

? 復蘇培養基（貼壁肝細胞需要，Cat#LV-Rec001）

? 純化培養基（如需要，隨細胞贈送）              

? 鋪板培養基（貼壁肝細胞需要，Cat#LV-WEP001）

? 維持培養基（貼壁肝細胞需要，Cat#LV-WEM001）

? 膠原包被培養板（貼壁肝細胞需要，Cat#LV-Coated）

? William's Medium E（WE）培養基（懸浮肝細胞需要，客戶自備）

? 非TC處理板（懸浮肝細胞需要，客戶自備）

? 無菌15mL離心管

? 一次性移液管

? 寬口移液槍頭（普通移液槍頭剪去尖頭，再滅菌使用）

? 移液槍

? 恒溫水浴鍋（37℃預熱，請用溫度計校準）

? 冷凍水平離心機（帶水平轉子，可離心15mL離心管）

? 生物安全柜

? 37^oC/5%CO₂培養箱

重要提示：解凍時，凍存細胞轉移必須使用液氮轉移；在整個復蘇實驗過程中必須全程使用寬口槍頭。

IV 貼壁細胞的復蘇與鋪板

在生物安全柜中，將10mL復蘇培養基（Cat#LV-Rec001）加入到15mL離心管中，37℃恒溫水浴鍋預熱20分鐘，然后轉移到生物安全柜中；

1. 純化培養基冰浴或4℃放置待用（如需要）；鋪板培養基37℃預熱。

2. 將凍存的肝細胞從液氮中迅速轉移至37℃恒溫水浴鍋中。將凍存管盡可能多的浸入水中（凍存管管蓋保持在液面以上），于水中順時針大范圍劃圈。

3. 解凍凍存管約90-120s，至凍存管中只有小塊碎冰漂浮即可。

4. 用75%酒精消毒凍存管，并將其轉移到生物安全柜。

5. 用寬口槍頭將細胞吸出，并以滴加方式轉移至10mL預熱的復蘇培養基中（注意：凍存管與槍頭上殘留細胞，可吸取1mL復蘇培養基潤洗凍存管與槍頭并將其混入離心管的培養基中），輕微上下顛倒2-3次混勻。

6. 得到的細胞懸液使用50g，常溫離心5分鐘。去上清，用鋪板培養基重懸，用臺盼藍排除法（V_細胞懸液：V_{0.4%臺盼藍}=9：1，細胞活率使用血球計數板手工計數，勿用細胞計數儀；細胞總數使用細胞計數儀計數）測定肝細胞的活力、細胞總數，建議細胞總數檢測3次，求取平均值；為節約時間，細胞活率檢測1次。

7. 如細胞活力大于70%，按照活細胞數1.2-1.5×10⁵cells/cm²鋪板到膠原包被培養板，搖勻，置37^oC/5%CO₂培養箱中培養16小時。

8. 如細胞活力小于70%，進行細胞純化：將細胞懸液離心，100g，常溫離心5分鐘，去上清，用2mL純化培養基（免費提供）重懸細胞，然后沿管壁向離心管小心加入1mL鋪板培養基（切勿擾動下層，加入后可見明顯分層）；800g，4℃離心10分鐘（升速為9，降速為1）離心后，吸取純化培養基和鋪板培養基之間的渾濁帶（活細胞層），轉移到新的15mL離心管中；加入2倍體積的鋪板培養基，混勻后，50g，常溫離心5分鐘；去上清，用4mL鋪板培養基重懸細胞。后續細胞計數及鋪板同第6，7步驟。

?重要提示：為了達到理想的鋪板效果，在細胞鋪板時必須確保均勻，不能出現細胞聚集情況（肉眼可判斷是否不均勻），否則細胞在聚集區密度過高導致不易貼壁；建議1：將細胞懸液混勻后，再加入到培養孔中，無需搖勻，在安全柜中靜置10分鐘，確保細胞沉降并黏附在板底（肉眼觀察是否有堆積情況），然后再小心轉移至培養箱中；建議2：在鋪板96孔和48孔板時，由于孔板的邊緣表面張力，導致“U”型液面，可將培養體系的培養基體積增加到1.5-2倍，無需搖勻，在安全柜中靜置10分鐘，確保細胞沉降并黏附在板底，然后再小心轉移至培養箱中，防止細胞在邊緣堆積，造成細胞貼壁出現邊緣多中間少的情況。

V 肝細胞維持及乙型肝炎病毒感染

1. 鋪板培養16小時后，細胞已經完全貼壁，移除鋪板培養基（含部分死細胞），加入維持培養基，每2天換液1次（注意：如想培養體系更干凈，可用WE培養基清洗，切勿使用PBS清洗細胞）。

2. 制備感染培養液：維持培養基中預先加入4%PEG8000并混勻，HBV病毒（HepAD38 MOI=500~1000, 純化病人血清 MOI=100~500，更高的MOI可能進一步提高感染效率）。

3. 移除舊培養液，加入感染培養液，在37℃/5% CO₂培養箱中培養16小時或過夜。

4. 移除感染培養液后，用維持培養基清洗3次，再加入維持培養基，在37℃/5%CO₂培養箱中繼續培養。

5. HBV感染后每2天收上清1次，用于病毒抗原及HBV DNA檢測，收集3dpi、5dpi、7dpi、9dpi上清，9dpi可結束細胞培養，更長的培養時間取決于細胞狀態 (dpi: 感染后培養天數)。

細胞復蘇后不可再凍存

VI 關于售后

如您發現產品有任何質量問題，請您收集原始數據，并第一時間聯系公司銷售或者技術支持，公司安排人員保證售后。每個實驗室條件不同，操作人員習慣不同，熟練程度不一樣，實驗失敗存在客觀因素。如未嚴格按照說明書操作、超過售后時限，公司不做售后，請老師理解與支持。

售后有效期與提供的原始數據：

復蘇問題：立刻報告異常；提供臺盼藍染色或者AO/PI染色。

污染問題：復蘇96小時以內；提供相差顯微鏡照片。

純度問題：一個月內；提供免疫熒光或者流式結果。

VII 聯系電話

公司電話：0755-28284050

技術支持：19902901483（周博士）