運輸方式
液氮運輸
1、吸附式液氮運輸，無游離液氮，冒白煙即說明正常。
2、溫度監測設備嚴密監控運輸過程中的罐內溫度，如發現異?？煽截悳囟扔涗泝x上的PDF和excel數據（溫度監測設備一頭可拔掉，顯示USB接頭，插入電腦即可拷貝數據，如遇到困難，可聯系銷售人員和技術支持解決）。
3、合金密碼鎖，保證從發出到收貨，沒有第三方可以打開液氮罐接觸細胞，保護細胞安全。
4、GPS定位器，細胞運輸軌跡全程掌握，防止丟件。
5、液氮罐、溫度監測設備、合金密碼鎖、GPS定位器為回收部件，請妥善保管，禁止破壞，否則會被拉入黑名單。
文章引用
略
適用范圍
1、肝臟基礎研究，包括基礎生命科學研究、病毒感染、基因表達調控。
2、藥物開發：藥物藥效、藥物毒性、藥物代謝、藥物相互作用。
基因操作方法
1、慢病毒，MOI=30-50可達到接近100%感染效率，需提前測試；
2、AAV，MOI=10^5可達到80%以上感染效率，需提前測試；
3、ASGPR-GalNac自由攝取，小核酸需提前修飾GalNac，可達到80%以上遞送效率；
4、不推薦Lipo2000/3000，原代肝細胞轉染毒性大、效率低，除非已經測試沒有問題。
由于我司產品說明書半年更新一次，以下步驟僅作參考，以公司隨貨說明書為準
II 試劑與材料
? 小鼠原代肝細胞（Cat# LV-PMH001/2）
? 復蘇培養基（Cat#LV-Rec001）
? 純化培養基（如需要，隨細胞贈送）
? 鋪板培養基（貼壁肝細胞需要，Cat#LV-WEP006）
? 維持培養基（貼壁肝細胞需要，Cat#LV-WEM006）
? 膠原包被培養板（貼壁肝細胞需要，Cat#LV-Coated）
? William's Medium E（WE）培養基（懸浮肝細胞需要，客戶自備）
? 非TC處理板（懸浮肝細胞需要，客戶自備）
? 無菌15ml離心管
? 寬口移液槍頭（普通移液槍頭剪去尖頭，再滅菌使用）
? 移液槍
? 恒溫水浴鍋（37℃預熱，請用溫度計校準）
? 冷凍水平離心機（帶水平轉子，可離心15ml離心管）
? 生物安全柜
? 37oC/5%CO2培養箱
? 75% 酒精
重要提示：解凍時，凍存細胞轉移必須使用液氮轉移；在整個復蘇實驗過程中必須全程使用寬口槍頭。
IV 貼壁細胞的復蘇與鋪板
1. 在生物安全柜中，將10mL復蘇培養基（Cat#LV-Rec001）加入到15mL離心管中，37℃恒溫水浴鍋預熱20分鐘，然后轉移到生物安全柜中；純化培養基冰浴或4℃放置待用（如需要）；鋪板培養基37℃預熱。
2. 將凍存的肝細胞從液氮中迅速轉移至37℃恒溫水浴鍋中。將凍存管盡可能多的浸入水中（凍存管管蓋保持在液面以上），于水中順時針大范圍劃圈。
3. 解凍凍存管約90-120s，至凍存管中只有小塊碎冰漂浮即可。
4. 用75%酒精消毒凍存管，并將其轉移到生物安全柜。
5. 用寬口槍頭將細胞吸出，并以滴加方式轉移至10mL預熱的復蘇培養基中（注意：凍存管與槍頭上殘留細胞，可吸取1mL復蘇培養基潤洗凍存管與槍頭并將其混入離心管的培養基中），輕微上下顛倒2-3次混勻。
6. 得到的細胞懸液使用50g，常溫離心5分鐘。去上清，用鋪板培養基重懸，用臺盼藍排除法（V細胞懸液：V0.4%臺盼藍=9：1，細胞活率使用血球計數板手工計數，勿用細胞計數儀；細胞總數使用細胞計數儀計數）測定肝細胞的活力、細胞總數，建議細胞總數檢測3次，求取平均值；為節約時間，細胞活率檢測1次。
7. 如細胞活力大于70%，按照活細胞數0.8-1.0×105cells/cm2鋪板到膠原包被培養板，搖勻，置37oC/5%CO2培養箱中培養16小時。
如細胞活力小于70%，進行細胞純化：將細胞懸液離心，100g，常溫離心5分鐘，去上清，用2mL純化培養基（免費提供）重懸細胞，然后沿管壁向離心管小心加入1mL鋪板培養基（切勿擾動下層，加入后可見明顯分層）；800g，4℃離心10分鐘（升速為9，降速為1）離心后，吸取純化培養基和鋪板培養基之間的渾濁帶（活細胞層），轉移到新的15mL離心管中；加入2倍體積的鋪板培養基，混勻后，50g，常溫離心5分鐘；去上清，用4mL鋪板培養基重懸細胞。后續細胞計數及鋪板同第6，7步驟。
v 重要提示：為了達到理想的鋪板效果，在細胞鋪板時必須確保均勻，不能出現細胞聚集情況（肉眼可判斷是否不均勻），否則細胞在聚集區密度過高導致不易貼壁；建議1：將細胞懸液混勻后，再加入到培養孔中，無需搖勻，在安全柜中靜置10分鐘，確保細胞沉降并黏附在板底（肉眼觀察是否有堆積情況），然后再小心轉移至培養箱中；建議2：在鋪板96孔和48孔板時，由于孔板的邊緣表面張力，導致“U”型液面，可將培養體系的培養基體積增加到1.5-2倍，無需搖勻，在安全柜中靜置10分鐘，確保細胞沉降并黏附在板底，然后再小心轉移至培養箱中，防止細胞在邊緣堆積，造成細胞貼壁出現邊緣多中間少的情況。
V 肝細胞維持培養
1. 鋪板培養4-6小時后，細胞已經完全貼壁，移除鋪板培養基（含部分死細胞），加入維持培養基，每2天換液1次。
2. 小鼠原代肝細胞具有有限的增殖能力，具有明顯的接觸抑制特性，且肝細胞的分化特性及其培養時間依賴于高密度的細胞培養。
3.小鼠原代肝細胞體外維持時間相對較短，建議實驗在鋪板后3天內完成，最長不超過5天，不建議對小鼠肝細胞進行傳代培養。
細胞復蘇后不可再凍存
VI 關于售后
如您發現產品有任何質量問題，請您收集原始數據，并第一時間聯系公司銷售或者技術支持，公司安排人員保證售后。每個實驗室條件不同，操作人員習慣不同，熟練程度不一樣，實驗失敗存在客觀因素。如未嚴格按照說明書操作、超過售后時限，公司不做售后，請老師理解與支持。
售后有效期與提供的原始數據：
復蘇問題：立刻報告異常；提供臺盼藍染色或者AO/PI染色。
污染問題：復蘇96小時以內；提供相差顯微鏡照片。
純度問題：一個月內；提供免疫熒光或者流式結果。
VII 聯系電話
公司電話：0755-28284050
技術支持：19902901483（周博士）
